• 專(zhuān)科分類(lèi)： 消化
• 檢查分類(lèi)： 肝功能檢查
• 適用性別： 男女均適用
• 是否空腹： 　空腹
• 手術(shù)參考價(jià)： 10元
• 科　室： 消化

原理：

（1）改良咖啡因（J-G）法的原理：血清中結(jié)合膽紅素可直接與重氮試劑反應(yīng)，產(chǎn)生偶氮膽紅素；在同樣條件下，游離膽紅素需有加速劑使膽紅素氫鍵破壞后與重氮試劑反應(yīng)。咖啡因、苯甲酸鈉為加速劑，醋酸鈉維持pH同時(shí)兼有加速作用。抗壞血酸（或疊氮鈉）破壞剩余重氮反應(yīng)，終止結(jié)合膽紅素測(cè)定管的偶氮反應(yīng)，防止游離膽紅素的緩慢反應(yīng)。加入堿性酒石酸鈉使最大吸光度由530nm轉(zhuǎn)移到598nm，非膽紅素的黃色色素及其他紅與棕色色素產(chǎn)生的吸光度降至可略而不計(jì)，使靈敏度和特異性增加。最后形成的綠色是由藍(lán)色的堿性偶氮膽紅素和咖啡因與對(duì)氨基苯磺酸之間形成的黃色色素混合而成。

（2）膽紅素氧化酶法的原理：膽紅素氧化酶（BOD）催化膽紅素氧化，生成膽綠素，后者進(jìn)一步氧化生成淡紫色化合物，在450nm波長(zhǎng)比色，吸光度的下降值（△A）與血清膽紅素濃度呈正比。

試劑：

（1）改良咖啡因（J-G）法：

①咖啡因-苯甲酸鈉試劑：稱(chēng)取無(wú)水醋酸鈉41.0g（或CH3COONa·3H2O63.0g），苯甲酸鈉38.0g，乙二胺四乙酸二鈉（EDT-ANa2）0.5g，溶于約500ml蒸餾水中，再加入咖啡因25.0g，攪拌使溶解（加入咖啡因后不能加熱溶解），用蒸餾水補(bǔ)足至1000ml，混勻。用濾紙過(guò)濾，置棕色瓶，室溫保存。

②堿性酒石酸鈉溶液：稱(chēng)取氫氧化鈉75.0g，酒石酸鈉（Na2C4H4O6·H2O）263.0g，用蒸餾水溶解并補(bǔ)足至1000ml，混勻。置塑料瓶中，室溫保存。

③5.0g/L亞硝酸鈉溶液：稱(chēng)取亞硝酸鈉（NaNO2）5.0g，用蒸餾水溶解并稀釋到100ml，混勻，置棕色瓶中，冰箱保存，穩(wěn)定不少于3個(gè)月。作10倍稀釋成0.5g/L，貯冰箱穩(wěn)定不少于2周。

④5.0g/L對(duì)氨基笨磺酸溶液：稱(chēng)取對(duì)氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g/L，溶于800ml蒸餾水中，加入濃鹽酸15ml，用蒸餾水補(bǔ)足至1000ml。

⑤重氮試劑：臨用前取5.0g/L亞硝酸鈉溶液0.5ml和5.0g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液20ml混合。

⑥5.0g/L疊氮鈉溶液：稱(chēng)取疊氮鈉0.5g，以蒸餾水溶解并稀釋至100ml。

⑦膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液

A.一般用游離（非結(jié)合）膽紅素配制標(biāo)準(zhǔn)液，因此配制標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋劑需含白蛋白?？捎门Ｑ灏椎鞍祝?0g/L）或人血清代替人血清白蛋白。后者方法如下：收集無(wú)溶血、無(wú)黃疸、無(wú)脂濁的新鮮血清，混合，必要時(shí)可用濾菌器過(guò)濾。取過(guò)濾后的血清1ml，加入24ml新鮮生理鹽水，混合。在414nm波長(zhǎng)，1cm光徑，以生理鹽水調(diào)零點(diǎn)，其吸光度應(yīng)小于0.100；在460nm的吸光度應(yīng)小于0.04。

B.配制標(biāo)準(zhǔn)液的膽紅素須符合下列標(biāo)準(zhǔn)：純膽紅素的氯仿溶液，在25℃條件下，光徑10±0.01mm，波長(zhǎng)453mm，摩爾吸光系數(shù)應(yīng)在60700±1600范圍內(nèi)；改良J-G法偶氮膽紅素的摩爾吸光系數(shù)應(yīng)在74380±866。

C.膽紅素貯存標(biāo)準(zhǔn)液，171μmol/L（10mg/dl）：準(zhǔn)確稱(chēng)取符合要求的膽紅素10mg，加入1ml二甲亞砜，用玻璃棒攪拌，使成混懸液。加入0.05mol/L碳酸鈉溶液2ml，使膽紅素完全溶解，移入100ml容量瓶中，以稀釋用血清洗滌數(shù)次并入容量瓶中，緩慢加入0.1mol/L鹽酸2ml，邊加邊搖（勿用力，以免產(chǎn)生氣泡）。最后以稀釋用血清補(bǔ)足至100ml。配制過(guò)程中應(yīng)盡量避光，貯存容器用黑紙包裹。置4℃冰箱3天內(nèi)有效，但要求配后盡快作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

（2）膽紅素氧化酶法：

①0.1mol/LTris-HCl緩沖液（pH8.2：稱(chēng)取Tris1.211g，膽酸鈉172.3mg，SDS432.6mg，溶于90ml蒸餾水中，在室溫（25～30℃）用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.2（約用6ml），再加蒸餾水至100ml，置冰箱保存。此液含4mmol/L膽酸鈉、150mmol/LSDS。

②BOD溶液：如系凍干品，按說(shuō)明書(shū)要求復(fù)溶，但復(fù)溶后冰箱保存不宜過(guò)長(zhǎng)（約可保存1周）。如系液體（可能含有甘油），置冰箱或冰室可保存較長(zhǎng)時(shí)間，BOD貯存液的酶活性一般在數(shù)千至1～2萬(wàn)U/L，BOD工作液的酶活性可按反應(yīng)液中BOD終濃度達(dá)0.3～1.0U/ml計(jì)算。

③膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液：342μmol/L：按膽紅素測(cè)定J-G法配制，或市售合乎要求的標(biāo)準(zhǔn)液。

操作方法：

（1）改良咖啡因（J-G）法：按表1操作。

充分混勻后，波長(zhǎng)600nm，對(duì)照管調(diào)零，讀取各管吸光度；或用蒸餾水調(diào)零，讀取測(cè)定管及對(duì)照管吸光度，用測(cè)定管吸光度與對(duì)照管吸光度之差（AU-AC），在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的膽紅素濃度。

（2）膽紅素氧化酶法：按表2進(jìn)行操作。

加入BOD溶液后立即混勻，置37℃水浴5min，用分光光度計(jì)，在450或460nm波長(zhǎng)，蒸餾水調(diào)零，讀各管吸光度。用于對(duì)照管的比色杯與非對(duì)照管的比色杯不得混用。