淋病檢查

實驗室檢查：

　　淋球菌實驗室檢查包括涂片，培養(yǎng)檢查淋球菌、抗原檢測，藥敏試驗及PPNG測定，基因診斷。

　　(一)涂片檢查：

　　取患者尿道分泌物或宮頸分泌物，作革蘭氏染色，在多形核白細胞內(nèi)找到革蘭氏陰性

　　雙球菌。涂片對有大量膿性分泌物的單純淋菌性前尿道炎患者，此法陽性率在90%左右，可以初步診斷。女性宮頸分泌物中雜菌多，敏感性和特異性較差，陽性率僅為50-60%，且有假陽性，因此世界衛(wèi)生組織推薦用培養(yǎng)法檢查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌較少，陽性率低，因此要取前列腺按摩液，以提高檢出率。

　　咽部涂片發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性雙球菌不能診斷淋病，因為其他奈瑟菌屬在咽部是正常的菌群。另外對癥狀不典型的涂片陽性應作進一步檢查。

　　(二)培養(yǎng)檢查：

　　淋球菌培養(yǎng)是診斷的重要佐證，培養(yǎng)法對癥狀很輕或無癥狀的男性、女性病人都是較敏感的方法，只要培養(yǎng)陽性就可確診，在基因診斷問世以前，培養(yǎng)是世界衛(wèi)生組織推薦的篩選淋病的唯一方法。目前國外推薦選擇培養(yǎng)基有改良的Thayer-Martin(TM)培養(yǎng)基和New York City(NYC)培養(yǎng)基。國內(nèi)采用巧克力瓊脂或血瓊脂培養(yǎng)基，均含有抗生素，可選擇地抑制許多其他細菌生長。在36℃，70%濕度，含5%-10%CO2(燭缸)環(huán)境中培養(yǎng)，24-48小時觀察結果。培養(yǎng)后還需進行菌落形態(tài)，革蘭氏染色，氧化酶試驗和糖發(fā)酵試驗等鑒定。培養(yǎng)陽性率男性80%-95%，女性80-90%。

　　(三)抗原檢測

　　1.固相酶免疫試驗(EIA)：可用來檢測臨床標本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地區(qū)而又不能作培養(yǎng)或標本需長時間遠送時使用，可以在婦女人群中用來診斷淋球菌感染。

　　2.直接免疫熒光試驗：通過檢測淋球菌外膜蛋白I的單克隆抗體作直接免

　　疫熒光試驗。但目前在男女二性標本的敏感不高，特異性差，加之實驗人員的判斷水平，故該實驗尚不能推薦用來診斷淋球菌感染。

　　(四)基因診斷

　　1.淋球菌的基因探針診斷

　　淋球菌的基因探針診斷，所用的探針有：質粒DNA探針，染色體基因探針和rRNA基因探針。

　　(1)質粒DNA探針

　?、?隱蔽質粒DNA探針，淋球菌質粒分為三種：接合性質粒，分子最大，為36kb DNA; 耐藥性質粒包括兩個質粒，DNA長分別為5.6kb和7.1kb;隱蔽質粒4.2kb。其中隱蔽質粒存在于96%的臨床淋球菌分離株中，其它奈瑟菌不含有此質粒，故可用它的序列作為特異DNA探針檢測淋球菌。Torres采用核酸雜交技術檢測淋球菌，所用探針為隱蔽質粒。用該探針對134株淋球菌和131株相關菌株的檢測，有124株淋球菌雜交反應陽性，占93%，還可與個別其它的奈瑟菌出現(xiàn)交叉反應，對測定探針的敏感性實驗表明可檢出102CFU淋球菌。研究證明隱蔽質粒中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色體中(包括不含該質粒的菌株)。因此CPPB基因探針具有良好的特異性和敏感性。Torres等用CPPB基因探針檢測了201份臨床標本， 采用非放射性地高辛標記系統(tǒng)， 其敏感性和特異性分別為95%和98%。

　　② 耐藥性質粒DNA探針

　　淋球菌的抗藥質?？煞譃椋?/p>

①產(chǎn)青毒素酶淋球菌(PPNG)其β-內(nèi)酰胺酶陽性;

②具有高水平的質粒介導的耐四環(huán)素淋球菌(TRNG)。

　　PPNG菌株是1976年首次在實驗室分離得到的，該菌中含有編碼產(chǎn)青毒酶的基因，該基因既可整合于染色體上也可出現(xiàn)在質粒DNA中，而后者居多，稱之為產(chǎn)青毒素酶質粒，質粒有二種，大小分別為7.4kb和5.3kb。Pescador1998年設計一特異的檢測淋球菌編碼β-內(nèi)酰胺酶基因的探針，采用酶化學發(fā)光法標記，液相雜交，用測光計測是特異雜交體的光量。在4h內(nèi)可檢測104-105CFU的PPNG菌株。TRNG菌株雖對四環(huán)素耐藥，但通常對β-內(nèi)酰胺酶類及喹諾酮類抗菌素敏感。因此，在實驗室藥敏檢測中可歸為敏感細菌。Pescador用抗四環(huán)素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探針，該基因介導抗四環(huán)素，用酶化學發(fā)光標記，液相雜交，4h內(nèi)可直接從臨床標本中檢出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。

　　(2)染色體探針

　　染色體探針包括已知功能的基因探針，如菌毛DNA探針和paI基因探針，這些基因在淋球菌感染人細胞的過程中起著重要作用;未知功能的基因探針，這些探針序列與染色體的特定序列互補，但目前還不知這些基因序列的功能。以上兩種染色體探針由于在淋球菌中互補序列的拷貝數(shù)較低，檢測靈敏度較低，因此一般用的不多，除非有特殊的研究目的。

　　(3)rRNA基因探針

　　rRNA基因探針是將與rRNA互補的DNA作為探針，該探針的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探針的特點是：

①可以增加探針檢測的靈敏度，rRNA基因探針可同時檢測rRNA分子和DNA分子;

②rRNA具有進化上的保守性;

③雜交方法簡便、快速;

④由于rRNA的含量較高，標本不需增菌。美國Gen-Probe公司生產(chǎn)的淋球菌檢測探針PACE C，是以rRNA 及其基因為檢測靶序列，采用放射性標記，在2h內(nèi)可以完成檢測，Peter用這種探針檢測395個臨床標本，結果靈敏度和特異性分別為92.9%，99.4%，他認為PACE C系統(tǒng)篩查臨床標本中淋球菌是一個可靠的方法。該探針還可以檢測無癥狀淋球菌感染者，這是目前培養(yǎng)難于達到的。

　　2、淋球菌的基因擴增檢測

　　上面講述的探針技術檢測淋球菌的方法，雖然比培養(yǎng)方法在靈敏度，特異性和方便性上有了很大的提高，但其仍有一定的局限性，如多數(shù)情況下需要標本的淋球菌濃度很高，PCR技術和連接酶鏈反應的出現(xiàn)進一步提高了檢測淋球菌的靈敏性，它具有快速、靈敏、特異、簡便的優(yōu)點，可以直接檢測臨床標本中極微量的病原體。

　　(1)淋球菌DNA的提取

　　①培養(yǎng)菌的DNA提取

　　將培養(yǎng)得到的淋球菌，以102cfu/ml的濃度溶于堿性裂解液中裂解，裂解液組成為：1M NaCl 1M NaOH和1%Sodium dodecyl sulphate。將裂解液混勻后煮沸1min，然后用100mol/L的1M Tris pH7.0中和堿性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次，酚—氯仿抽提一次，然后用無水乙醇或異丙醇沉淀DNA，提取的DNA溶于30mol/L蒸餾水或TE緩沖液中。

　?、谂R床棉拭子標本的提取

　　將貼有分泌物的棉拭子在2ml的無菌生理鹽水中或PBS緩沖液中擠壓洗1min，以便將標本盡量溶于溶液中，將棉拭子棄去，懸浮液于2-3000r/min離心5min，吸去上清液，細胞重新溶于100mol/L 1x PCR緩沖液，其中含Tween 20 0.45%，蛋白酶K 200μg/ml，細胞懸浮液于50-60℃溫浴1h，然后95℃加熱10min以滅活蛋白酶K，12000 r/min離心10min，上清液含DNA模板。

　　(2)PCR引物的設計

　　由于淋球菌隱蔽質粒CPPB基因在淋球菌染色體中和4.2kb隱蔽質粒中都有存在，同時在96%的淋球菌中都有該隱蔽質粒，因此很多PCR引物設計在CPPB基因區(qū)。

　　靶基因 引物序列 片段長度(bp)

　　CPPB NG1 5′GTT TGG CTG GTT GAT TCA AG 3′ 633

　　NG2 5′GCA AGA TTT CCG ATTT GGC G 3′

　　CPPB HO1 5′GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3′ 390

　　HO2 5′CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3′

　　rRNA 引物1 5′-AGG CTG TTG CCA ATA TCG GC-3′ 206

　　引物2 5′-ACA CTC GAG TCA CCC AGT TC-3′

　　CPPB GC1 5′CTT ATC GTT TGG CTG GTT GAT TC 3′ 435

　　GC2 5′ACC AAG ACC AAA GGT TTG ACA CTG 3′

　　GC3 5′ATT TTC CAG TGT CAA AC 3′ 241

　　GC4 5′TAT TCA AGC CCT ATC TG 3′

　　(3)PCR擴增

　　取淋球菌DNA提取液2μl，加入28μl的反應液中，最終PCR反應液中含dNTP各100μmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2 1.5mmol/L，加無菌石蠟油30μl，1000r/min離心30s，進行PCR擴增循環(huán)，反應條件：94℃變性1min，然后94℃ 30s，57℃1min，72℃1min。共30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

　　擴增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳30min，溴化乙錠染色，紫外燈下可見擴增的DNA熒光條帶，分子大小應與所用引物擴增靶序列的大小一致。

　　(4)PCR的靈敏性和特異性

　　由于CPPB在不含有隱蔽質粒的淋球菌染色體上也會含有CPPB基因，再加96%的淋球菌都會有隱蔽質粒，因此用CPPB作為靶序列的引物具有極高的敏靈性，實驗證明，一般傳統(tǒng)一步PCR(GC1-GC2)方法可以檢出3個淋球菌，而用單管巢式PCR(GC2-GC4)可以檢出≤0.3淋球菌(9個CPPB基因)。這些引物經(jīng)特異性實驗，只能擴增淋球菌的DNA，而對非淋球菌奈瑟氏菌擴增不出特異產(chǎn)物。

　　(5)單管巢式PCR方法

　　是在傳統(tǒng)巢式PCR的基礎上將兩對PCR引物作特殊的設計，巢式外側兩個引物(GC1，GC2)為25b退火溫度比較高(68℃)，巢式內(nèi)側兩個引物GC3-GC4為17b退火溫度較低(46℃)，PCR反應液的其它成分與一般PCR相同。這樣，通過控制退火溫度(68℃)使外側引物先行擴增，經(jīng)過20-30次循環(huán)后(第一次PCR)，再降低退火溫度(46℃)使內(nèi)側引物以第一次PCR產(chǎn)物為模板進行巢式擴增，該PCR的靈敏度可達到檢出0.3個淋球菌。

　　(6)淋球菌連接酶鏈反應(LCP)檢測方法

　　目前PCR檢測淋球菌的方法被廣泛地使用。其特異性，靈敏性不斷提高。同時另一種基因診斷技術——連接酶鏈反應(LCP)也以其高特異，高靈敏性被應用于淋球菌的檢測中。LCP 與PCR不同之處在于LCP 用四對引物，所用酶是連接酶。連接酶可以將兩條相鄰引物連接起來。連接起來的兩條引物可以作為另兩條引物的模板，后者在連接酶作用下連接，又可作為模板，如此進行30-40次循環(huán)。LCP所用的模板處理方法與PCR模板制備相等。LCP所用的探針除了可以設計在CPPB基因上，也可以設計在染色體基因序列上，例如opa-1基因。美國Abbott實驗室在opa-1基因的48bp長的區(qū)域內(nèi)設計了4個LCP探針，由于opa-1基因在淋球菌的染色體中有11次重復。因此，該組LCP探針具有高靈敏性和特異性。LCP反應過程：

　　將模板加入LCP反應液中，LCP反應液：20mmol/L Tris-HCl pH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2;1 mmol/L EDTA; 10 mmol/L NAD ;10 mmol/L DTT，有標記物的兩個相鄰探針各40fmol/L，未標記的探針各40fmol/L，15U耐熱連接酶，反應條件：97℃1s，55℃1s，62℃50s，其40循環(huán)。100μl反應產(chǎn)物加入酶標板微孔中，進行顯色反應，最后用酶標儀讀取光值。根據(jù)Buimer的實驗證明，LCP在檢測男性尿道棉拭子標本的靈敏度為100%，尿液標本為88.9%，女性宮頸棉拭子標本為95.4%。LCP方法的特異性高達100%，這一點明顯高于PCR的特異性，避免了假陽性的發(fā)生。

　　3. 臨床基因診斷淋球菌的注意事項

　　目前臨床檢測淋球菌的基因診斷方法主要采用PCR方法，但是該方法在臨床檢測中應注意幾個問題。

　　(1)引物設計 除了以上所列的淋球菌PCR引物外，還可從在其它基因上設計，但

　　是引物序列應具有特異性。因為細菌的染色體較大，許多基因序列并沒有搞清楚;同時細菌之間或近或遠有一定的同源性，而且細菌所含質粒序列間也存在同源性，因此設計引物一定要進行基因數(shù)據(jù)庫比較分析，同時進行特異性和靈敏性實驗，從中選擇引物進行臨床檢測。

　　(2)臨床標本處理 對臨床標本來講，PCR模板要求越純越好。這就要求在采集標本時要取到準確的位置，對于無癥狀患者要適當多采樣，以保證采集到病原體細菌。另外由于臨床標本成分比較復雜，有時簡單處理的標本PCR擴增效果并不理想，這可能是由于雜質過多造成的，需要進一步純化，如用酚一氯仿抽提法純化，結果將會好轉。這種純化方法比較麻煩，目前已有商品化的DNA純化試劑盒，可以較簡便地從臨床標本中提取高純度的DNA。

　　(3)PCR產(chǎn)物的檢測方法 不久以前臨床PCR檢測淋球菌幾乎都采用電泳的方法進行PCR產(chǎn)物的鑒定。該方法存在許多問題，如由于肉眼觀察的主觀性而造成假陽性和假陰性的結果。目前用雜交顯色法代替電泳法，提高了結果判斷的特異性和靈敏性。

　　總之，PCR方法與LCP方法比傳統(tǒng)的培養(yǎng)法在靈敏性和特異性上有了很大的提高，時間也大大縮短。隨著基因診斷技術的不斷改進。PCR方法與LCP方法在淋球菌的檢測將會成為常規(guī)的檢測方法。

　　(五)藥敏試驗：

在培養(yǎng)陽性后進一步作藥敏試驗。用紙片擴散法做敏感試驗，或用瓊脂平皿稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)，用以指導選用抗生素。

　　(六)PPNG檢測：

β-內(nèi)酰胺酶，用紙片酸度定量法，使用Whatman I號濾紙PP-NG

　　菌株能使其顏色由藍變黃，陽性為PPNG，陰性為N-PPNG。